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三、Heochst 33342/PI 双染色法
1. 悬浮生长的细胞在培养的状态下加入 Heochst 33342 ，终浓度为 1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低温 500 ~ 1000r/min 离心 5min 弃去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液，4℃避光染色 15min。
4. 400 目的筛网过滤 1 次。
5. 流式细胞仪分析：Heochst 33342 用氪激光激发的紫外线荧光，激发光波波长为352nm，发射光波波长为 400 ~ 500nm，产生兰色荧光；PI 用氩离子激光激发荧光，激发光波波长为 488nm，发射光波波长大于 630nm，产生红色荧光。分析兰色荧光对红色荧光的散点图或地形图。
6. 国内抗体药物生产公司结果判断：在兰色荧光对红色荧光的散点图上，结果为：正常细胞为低蓝光/低红光，凋亡细胞为高蓝光/低红光，坏死细胞为低蓝光/高红光。
注意事项：
① 在红色荧光对兰色荧光散点图上，还可见到细胞凋亡区向细胞坏死区迁移的轨迹，可能是凋亡细胞的 DNA 进一步降解的缘故。
② 用 Heochst 33342 染料与细胞孵育的时间不宜过长，一般控制在 20min 之内为宜。如果太长可引起 Heochst 33342 的发射光谱由蓝光向红光的迁移，导致红色荧光与兰色荧光的比例改变，从而影响结果的判断。