国内抗体药物生产公司β-内酰胺酶单克隆抗体和多克隆抗体的制备

国内抗体药物生产公司β-内酰胺酶单克隆抗体和多克隆抗体的制备

国内抗体药物生产公司原乳中β-内酰胺酶的检测方法有微生物杯碟法、快速试剂盒法、液相色谱法和双流向酶联免疫法。微生物杯碟法成本低廉。试剂盒法和酶联免疫法依据抗原 抗体特异性反应的基本特性，操作简单，速度快，特异性好。液相色谱法具有操作时间短、灵敏度高、准确的特点，但所需实验仪器要求较高。
　　本研究中制备β-内酰胺酶的多克隆抗体和单克隆抗体，拟通过双抗夹心法为后续的胶体金免疫层析试纸条的研制奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料与试剂
　　实验动物：日本大耳兔（雌性，两月龄），北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司；Balb/C小鼠（雌性，SPF级，六周龄）、昆明小鼠（18～22g），购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。
　　实验试剂：β-内酰胺酶，Sigma公司；penicillin酶，中国药品生物制品检定所；牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉，北京经日今典科技 有限公司；单组份TMB显色液，北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，北京优博奥生物科技有限公 司；HAT、HT、PEG2000、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，Sigma公司；小鼠SP2/0细胞，本实验室保存；DMEM低糖培养基，GIBCO 公司；小鼠单克隆抗体亚型试剂盒，洛阳赛尔维实验器材有限公司。
　　仪器和设备：96孔聚苯乙烯酶标板、细胞培养板，JETBIOFIL公司；酶联免疫检测仪、凝胶成像仪，BIO-RAD公司；紫外分光光度计，UNICO公司。
　　1.2 免疫抗原的选择
　　使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析β-内酰胺酶和penicillin酶两种蛋白的分子质量及纯度。分离胶10%，积层胶4%，电泳缓冲液为甘氨酸。
　　1.3 多克隆抗体的制备
　　使用β-内酰胺酶对3只日本大耳兔进行免疫。对每只大耳兔，取700μgβ-内酰胺酶，用pH7的0.1mol/LTris-HCL稀释至 500μL，与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化后于兔子背部皮下和两侧腹股沟多点注射。之后的加强免疫使用同剂量免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂充分 乳化，背部皮下多点注射，每次免疫间隔两周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳缘静脉采血，分离血清，检测免疫效果。五免后3d心脏采血，分离血 清。
　　1.4 ELISA筛选方法的建立
　　1.4.1 包被原浓度的确定采用方阵法，用系列浓度稀释的penicillin酶横向包被96孔酶标板，将倍比稀释的一抗纵向加入，用间接ELISA法确定最佳抗原包被浓度。
　　1.4.2 包被条件的确定选择4℃overnight，37℃1h，37℃2h3种方式包被，以确定最佳包被条件。
　　1.4.3 封闭液的选择选择0.2%明胶、5%脱脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%BSA+5%蔗糖、3%BSA+0.05%吐温+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐温+3%蔗糖7种封闭液封闭，确定最佳封闭液。
　　1.4.4 封闭时间的优化封闭时间选择0.5，1，2h，采用间接ELISA确定最佳封闭时间。