常用的蛋白纯化实验流程全人源化抗体的优点

　常用的蛋白纯化实验流程全人源化抗体的优点
　　3.1 Ni2+亲和层析纯化His-Tag
　　Ni2+可以与带有His6标签的融合蛋白结合，也可与咪唑进行结合。当标签蛋白杂质与层析柱表面结构中含有的蛋白杂质和Ni2+发生结合排斥效应时，向它们其中的依次地加入至少两个完全不同比例的相同浓度的咪唑溶液则可以通过自动过滤将所有这些标签蛋白杂质或与其它杂合蛋白的杂质分别准确地加以洗脱后固定沉积下来，从而才能够分离得到相对比较更高纯度的目标蛋白。实验流程如下：
　　（1）样品准备：样品经超声破碎后，测量蛋白质含量，确定合适的溶液浓度。样品用水中必须保持澄清、无白色细小颗粒物，否则就可能将会出现直接污染堵塞样品柱子、缩短设备正常使用寿命。
　　（2）先分别用约为5倍柱体积的去离子水洗去约占20%用量的乙醇，再依次分别加入为约占10倍柱体积比例的Binding Buffer平衡柱子。
　　（3）根据目的蛋白的浓度确定上样体积。
　　（4）分取约20倍柱体积的Washing Buffer溶液混合洗涤至溶液无蛋白检出，收集所流出液。再加入约20倍柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白，此步骤可用于设置洗脱梯度。
　　（5）用5倍柱体积去离子水洗掉缓冲液。
　　（6）20%乙醇保存于4℃。
　　3.2 AKTA系统凝胶过滤层析实验步骤
　　（1）溶液和样品的准备：纯化所需缓冲液皆要去除工作液中气泡，浓缩后的蛋白需要用0.22 μm的滤膜过滤，低温保存。
　　（2）开机及清洗：打开电脑及仪器的电源，待AKTATM主机控制面板白灯常亮时则仪器自检完毕后，点击UNICORN软件，进入System control 操作界面。清洗A、B泵完成后自动停止。
　　（3）预平衡：清洗完成后，将泵头转移到平衡/洗脱缓冲液中，将所用管道的溶液置换为平衡/洗脱缓冲液，直至紫外、电导、柱前压三条基线趋于平稳。
　　（4）装柱：取下顶部装有乙醇的塞子，拧下系统连接线，将滴出溶液的一端放在柱顶部注入缓冲溶液，滴满后拧到柱上，拧紧顶部的同时松开柱下堵头，防止凝胶由于高柱压而塌陷。当液体从柱下端滴落时，将系统的另一端连接到柱的下端并拧紧。
　　（5）平衡：将柱内与系统中的溶液全部置换为缓冲液，溶液大概需要走2个柱体积。
　　（6）上样：使用超纯水和缓冲液多次清洗上样环。
　　（7）收集蛋白：选择Fraction collection→Peek fractionation，Insert→Feed tube, 输入每管收集体积，Insert→Exectue。停止收集时设置Fraction collection→Stop peek fractionation→Exectue。流速控制在0.5——0.8 mL/min；
　　（8）清洗及卸下层析柱：先用2个柱体积的超纯水清洗层析柱，再换成将1.5个柱体积的20％乙醇保存层析柱。清洗结束将流速调小，按“先下后上”的顺序将柱子封存好；
　　（9）将出峰图以及原始数据保存后，先关程序再关系统最后关机。