一、感受态制备
1）接种酵母受体菌单菌落于YPD 平板，30℃培养2 天；
2）挑取平板上的单菌落接种于10 ml YPD 液体培养基中，30℃摇床震荡过夜；
3）过夜培养后按1%左右的接种量接种到100 ml YPD 培养基中震荡培养至 OD 值1.2——1.5；
4）4℃，5000 rpm 离心5 min 收集沉淀菌体，用100 ml 预冷无菌水重悬菌体；
5）4℃，5000 rpm 离心10 min 收集沉淀菌体，用 100 ml 预冷无菌水重悬菌体；
6）再次4℃，5000 rpm 离心 10 min 收集沉淀菌体，用 100 ml 预冷无菌水重悬菌体；
7）20 ml，1 mol/L 山梨醇洗涤1 次；
8）将菌体溶于200 ul，1 mol/L 预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化
二、电转涂板
1）准备好80 ul 的酵母感受态与线性化的质粒 1-5 ug（冰上预冷15 min）混合，迅速放入0.2 cm 的电击杯中（电击杯冰上预冷灭菌），电击；
2）电击结束，迅速加入1 ml 山梨醇，涂平板（在摇床上培养1 h 后涂平板也可）；
3）MD 培养基生长3-4 天，ROB 培养基上生长4-5 天后，鉴定。
CDMO公司电击注意事项：
1）线性化质粒的含量在1-5 ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成；
2）感受态菌液收集，确定OD 值在 1.2-1.5 之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单OD 值不高，可能是OD 稀释倍数不够；
3）感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则：现做现用；且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染；
4）电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响；
5）电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作
三、挑单克隆
Mut+ 和Muts 表型的判断
待转化子在平板上生长一段时间后，进行Mut+ 和Muts 的筛选。挑取单克隆，在MM 及MD 培养基上划线或点（先在MM 平板上点，再在MD 平板上点，一个克隆换一次牙签），30℃培养2 天。观察，在MD 培养基上生长而在MM 培养基上不生长或长的很小即为Muts 表型，其余为Mut+ 表型。
四、PCR鉴定重组子的方法
模板的处理
1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12 小时）；
2.将除了模板之外的其它PCR 反应液的组分准备好，并分装。引物最好使用Kit 中己有的检测专用的引物，或者一条使用载体上的引物，一条使用基因的特异性引物（这样做可以鉴定非定向克隆的方向）；
3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮以下，放入一个灭菌的1.5 毫升离心管，对PCR 管和1.5 毫升离心管编号；
4.PCR扩增，1% agarose 电泳。
毕酵母基因组提取方法
1.接种重组和空质粒转化子于5 ml YPDZ培养基，GS115 菌于YPD 培养基作对照，30℃，培养16——18 小时。
2.室温下，1500 g离心5-10 min 收集茵体。
3.100 ul TE (pH 7.0)重悬，加入 300 ul EDTA (pH 8.0) 0.07M Tris -HC,3 u蔬基乙醇，l ul Lyticase ，37℃水浴30 min。
4.10000 g离心5——10 min，取沉淀，加90 ul TE 重悬。
5.200 ul 饱和酚，200 ul氯仿，混匀，离心30 s ，取上层水相。
6.加入两倍体积无水乙醇以及1/10 体积的NaAC，-20℃放置30 min;
7.10000 g离心20 min，弃上清;75%乙醇漂洗沉淀一次，
8.干燥后，加入15 ul的TE或H20溶解，-20℃备用。 |
100996990<100996990>
2024-02-19 14:37
只看该作者
|灌水专用