CDMO企业ips诱导脑类器官培养攻略

　脑类器官概述：
　　11月末，小爱曾为大家讲述了3D类器官培养，CDMO企业相信大家对“类器官”及“3D培养”已不陌生。现阶段，类器官的培养有多种不同的方法，而不同类器官的培养亦存在一定的差异，包括：视网膜、肠、甲状腺、肝、垂体、大脑...等。
　　以人脑为例，因其具有高度复杂性，现如今，很多脑部疾病的研究很难在生物模型中开展，故体外模拟技术成为现在类器官培养领域的一项前沿技术。通常，研究人员可在体外环境中对大脑组织进行培育，模拟大脑发育过程，进而能够观察到人脑变化，为更深层次的脑部研究开拓思路。
　　接下来，小爱将为大家送上一份冬日情书：Nature protocol 技术干货，为大家重点解析人脑类器官的培养过程。
　　ips诱导脑类器官流程：
　　图1 大脑类器官培养流程
　　1、培育EB ● 1-2h
　　1）在六孔板的一孔中培育hESC或iPSC克隆，至汇合度为70-80％。一般而言，六孔板的一个孔可以产出大约整个96孔板所需的EB。
　　流程A，通过feeder依赖的PSCs培育EB；流程B，通过feeder非依赖的hESC培育EB。关键步骤：干细胞集落的形态对于脑组织形成的成功至关重要。菌落应无分化迹象，并应显示多能性的最佳特征（图2）。
　　feeder依赖的PSCs培育EB
　　图2 人PSCs培育的大脑类器官发育进程
　　◆ 洗涤细胞，去除hESC培养基，加1mL不含钙和镁的D-PBS。后去除D-PBS，向6孔板的每个孔中加入1mL分散酶溶液，然后将细胞放回培养箱中孵育20-30min；
　　◆ 去除分散酶溶液，加入1mL低bFGF的hESC培养基。轻轻敲击培养皿，以去除培养皿上的克隆而不移除MEF和已分化细胞。将含有完整克隆的培养基转移至15mL锥形管，静置约1min使得克隆沉降到试管底部；
　　◆ 轻轻吸出含有单细胞和MEF的上清液，注意不要干扰贴壁的细胞克隆。另添加1mL低bFGF的hESC培养基，再次使克隆沉降，后去除上清液；
　　◆ 将克隆重悬于1mL的胰蛋白酶消化液（0.25%，含酚红）中，并在37°C下孵育2min。加入1mL的胰蛋白酶抑制剂，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出现单细胞浑浊为止。取两次5uL的细胞溶液进行计数，然后加入8mL低bFGF的hESC培养基；
　　◆ 在室温下以270×g离心细胞5min，同时加入等体积的台盼蓝标记死细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数。使用两次计数的平均值；
　　◆ 首先将细胞重悬于含有ROCK抑制剂（1:100，终浓度50uM）的1mL低bFGF的hESC培养基中，多次吹打以确保混匀单细胞悬液。然后添加额外适量的带有ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基，以每150uL悬液获得9000个活细胞；
　　◆ 低贴壁型的96孔板，每个孔中加入150uL悬液，后将其放回培养箱中。
　　feeder非依赖的hESCs培育EB
　　◆ 用1mL不含钙和镁的D-PBS洗涤细胞，并在六孔板的每个孔添加600uL不含钙和镁的0.5mM EDTA溶液，后将细胞放回培养箱中孵育4min；
　　◆ 轻轻吸出EDTA溶液而不干扰细胞克隆，后加入1mL的Accutase酶。将细胞放回培养箱中孵育4min；
　　◆ 采用1mL的mTeSR1培养基吹打细胞克隆，使其与培养皿分离。取其中2mL转移到15mL锥形管中，并使用1mL移液器吹打混合溶液，直到溶液中出现单细胞浑浊为止。取两次5uL的细胞溶液进行计数，后添加3mL mTeSR1培养基并混合均匀；
　　◆ 在室温下以270×g离心细胞5min，同时加入等体积的台盼蓝标记死细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数器对细胞进行计数。使用两次计数的平均值；
　　◆ 首先用1mL含ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基（1:100，终浓度50uM）重悬细胞，多次吹打以确保混匀单细胞悬液。然后添加额外适量的带有ROCK抑制剂的低bFGF的hESC培养基，以每150uL悬液获得9000个活细胞；
　　◆ 低贴壁型的96孔板，每个孔中加入150uL悬液，后将其放回培养箱中。